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                          高性能微球在多肽药物分离纯化中的应用
                          合肥博美生物科技有限责任公司 / 2022-05-05

                           

                          多肽药物由于自身结构复杂、稳定性差、浓度低以及与杂质结构相类似,其分离纯化是生产过程中最具挑战性的一部分。传统重结晶、精馏等有机小分子药物纯化方法不适用于多肽的分离纯化,高效液相色谱具有极高的分离纯化效率,且条件温和,在分离纯化过程中容易保持目标分子的生物活性,成为多肽药物分离纯化的重要工具。

                          目前用于多肽药物分离纯化的层析或色谱技术主要是有三种:

                          一是离子交换色谱,由于多肽是由氨基酸通过酰胺键连接成的高分子物质,不同多肽分子带的表面电 荷正负性质及表面电荷数量都不同而且会随着流动相的 pH 改变而改变,因此不同组份的多肽分子在离子层析介质的电荷作用力有较大差异,通过改变水溶液的盐浓度和 pH 来降低样品组份与离子交换色谱填料的电荷作用力从而对不同多肽组份进行洗脱分离。

                          二是反相色谱,多肽分子在极性较强的流动相如水的缓冲液中可以与色谱填料表面疏水基团形成较强的疏水作用力而吸附在固定性表面上,然后通过降低流动相极性即增加流动相有机溶剂的比例如甲醇、乙腈等按极性强弱先后洗脱分离不同多肽样品组分。

                          三是疏水作用色谱,与反相色谱相类似都是通过样品组份带有的疏水基团与色谱填料表面基团通过疏水作用力达到吸附的目的,然后通过调整流动相性质来改变这种疏水作用力来达到分离的目的。

                          多肽分离纯化色谱填料的选择

                          理想的多肽药物分离纯化色谱填料必须满足以下特性:
                          (a)高选择性,高分离度;
                          (b)柱效高,分辨率高;
                          (c)载量大;单位体积填料处理多肽样品的能力大
                          (d)化学性能稳定,适用 pH 范围宽(1-14);可在线清洗,耐脏性强,使用寿命长;
                          (e)机械强度大,反压低;易装柱;
                          (f)产品重现性好,性价比高。

                          然而在现实中很难找到一款填料能满足所有的要求,每种填料都有它自身的特性,选择填料要综合考虑成本,分离效率,产品纯度,稳定性等等。

                          目前用于多肽分析和分离纯化的液相色谱填料主要基质有三大类:
                          第一类是多孔二氧化硅(硅胶)为基质的色谱填料;
                          第二类是天然碳水高分子改性填料包括改性纤维素、葡聚糖、琼脂糖等;
                          第三类是合成高分子色谱填料包括交联聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等。

                          反相硅胶色谱已成为多肽分析和制备色谱的主流介质, 但硅胶表面的硅氧键耐碱性差使得这一填料不适合在碱性条件下分离和分析多肽分子和需要用碱性条件下再生的纯化分离过程中。

                          天然碳水高分子改性填料由于亲水强,能减少对生物分子的非特异性吸附等特点因此在分离过程中容易保持生物分子的生物活性而被广泛地用于生物大分子的分离纯化。

                          交联聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯由于机械强度好且合成聚合物微球的粒径, 粒径分布及孔道结构容易控制,通过表面亲水化改性后可以降低生物分子的非特异性吸附,而且克服了天然碳水高分子介质机械强度差,溶胀体积大的缺点,使生物分离纯化更加快速、高效。因此合成高分子填料被越来越多地替代天然高分子改性填料用于多肽分子的分离纯化。

                                                                 

                                                                                                                                 用于多肽分析和分离纯化的液相色谱填料主要基质性质对比
                                                                                                                                                                   图片来自纳微科技

                          1)硅胶色谱填料
                          在高效液相色谱领域,二氧化硅 (硅胶) 及硅胶键合分离填料因具有良好的机械强度,耐溶剂性,孔道结构及比表面积容易控制,优异的耐热性能,及表面富含易于键合或改性的硅羟基使得硅胶成为高效色谱填料应用历史最悠久也是应用最为广泛的高效液相色谱填料。

                          2)聚合物色谱填料
                          聚合物分离介质因其良好的分离效果、稳定的物理化学性质及高吸附载量,在多肽类药物的分离与纯化中得到越来越广泛的应用,也为多肽的分离介质选择提供了新的途径。

                          3)聚合物和反相硅胶色谱填料的互补性能
                          硅胶和聚合物为基质的填料是色谱分离和分析领域必不可少的两种性能互为补充的色谱介质。

                          硅胶基质机械强度大、柱效高、分辨率好,已广泛应用于有机化合物及中性分子的分析和大规模制备生产中;而聚合物基质填料则具有良好的化学稳定性及无与比拟的耐酸碱性,因此使用寿命长,可在线清洗适合生物分子的大规模纯化分离。

                          色谱填料孔径对多肽分离纯化的影响

                          除了体积排阻色谱外,其它色谱分离机理都离不开样品与色谱填料表面的作用。

                          色谱填料孔径大小、分布及比表面积对多肽分离性能也有重大的影响。对于大多数分离模式来说有效的比表面积越大,载量越大,但有效比表面积取决于目标样品的分子量、孔径大小及孔容积。

                          一般选择有效比表面积越大的填料越好,这样载量大,机械强度好。同时孔容积越大载量越大,分离效果也越好,但孔容积越大,机械强度越差。因此对于一般多肽分析和分离用色谱填料孔容积要求在 0.5-1.0 ml/g 左右,如果用于体积排阻利用分子筛性质的填料孔容积要求会大于 1.3 ml/g。

                          填料粒径大小及均一性对多肽分离纯化的影响

                          色谱填料的粒径主要影响填充柱的的柱效和背压。填料粒径越小,填充柱的柱效越高,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度。填料粒径越小,柱压也越高,因此对色谱系统的要求也越高,设备投资也越大,小粒径色谱填料的价格也高。

                          选择色谱粒径大小要综合考虑分离效率和成本。下图是用纳微科技 UniPS 系列不同粒径聚合物色谱填料(粒径分别为 10、20、30 微米)对多肽、蛋白等分离效果的影响。

                           

                                                                                                                                             

                          不同粒径的色谱填料对多肽和蛋白质分离效果的对比
                          图片来自纳微科技

                          除了粒径的大小外,色谱填料的粒径分布情况也是色谱填料性能的重要参数。当使用粒径均一的微球填料填充色谱柱时,因其紧密程度一致,有效减少了填充床的多路径效应,使溶质分子流过色谱柱时经历的路径长度基本相同,相应的保留时间也较一致,使色谱峰宽变窄,理论塔板数升高,从而获得较高的柱效(粒径均一性对分离柱效的影响如图 8 所示),在小分子及多肽的反相分离中获得较好的分离效果。

                           

                           

                                                                                                                                                                     

                          粒径均一性对分离柱效的影响
                          图片来自纳微科技

                          然而用于多肽药物分离纯化的色谱填料要求极高,世界上真正具备规?;苈闵仔枨蟮亩喾稚⒍嗫浊蛐喂杞旱某Ъ抑挥?Kromasil, Daisol,Fuji 及 Merck 等四家。

                          而可以生产聚合物色谱填料的厂家主要有美国 GE,日本 Tosoh 等少数公司。目前大多数市场上的色谱填料无论是硅胶基质还是聚合物基质粒径分布都较宽,因此开发单分散色谱填料的技术一直是业界的发展目标,也是该领域的技术难题。

                          纳微科技已成功地开发出单分散多孔聚合物微球,成为世界第一家开发出单分散硅胶填料的大规模生产的企业。后续纳微科技将继续致力于研究单分散微球材料的制备和应用,为单分散微球材料的发展贡献自己的力量。

                           

                           

                           

                           

                           

                           

                           

                           

                           

                           

                           

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